RIDASCREEN Веротоксин 1 и 2 SLT I/II
Назначение
Набор предназначен для диагностического обнаружения in vitro веротоксина 1 и 2 (шига-подобные токсины I и II типа) Escherichia coli в образцах кала и обогащенных культурах.
Введение
Энтеробактерии, относящиеся к виду Escherichia coli, являются нормальной кишечной флорой человека и многих сельскохозяйственных животных. Таким образом, они служат индикатором загрязнения воды и пищи фекалиями. Энтеробактерии относятся к грам-отрицательным факультативным анаэробным палочковидным бактериям, которые передвигаются с помощью перитрихиальных жгутиков. На основе О-антигенов (LPS, липополисахариды внешней мембраны) и Н-антигенов (антигены жгутиков) E. coli можно разделить на различные серотипы. E. coli относят к факультативно патогенным бактериям из-за различных патогенных факторов, которые часто кодируются в плазмидах или передаются фагами. С 1977 г. известны бактерии E. coli, которые способны продуцировать два цитотоксина - веротоксин 1 и 2. Гены для этих веротоксинов (VT) локализованы в хромосоме в области профага. Были изолированы E. coli, в которых содержались либо оба гена, либо всего лишь один. Из-за сходства веротоксинов с шига-токсином Shigella dysenteriae, их также называют шиго-подобным токсином I и II (SLT-I и –II). Некоторые из этих веротоксинов, продуцируемых E. coli (VTEC), могут вызывать тяжелую форму геморрагической диареи, которая возникает из-за последующего образования патогенных факторов. «Прототип» этих геморрагических E. coli (ЕНЕС) был впервые обнаружен в 1982 г., он принадлежал к серотипу 0157:Н7. В настоящее время описаны ЕНЕС различных О-серотипов. К важным дополнительным патогенным факторам, которые характерны для бактерий ЕНЕС типов, относят кодируемые в плазмидах энтерогемолизин и тимин-адгезин. Их ген (еае А) вместе с другими вирулентными факторами локализован в островке патогенности (PAI) хромосомы. Клинические симптомы заболеваний, вызываемых ЕНЕС, колеблются от легких до крайне тяжелых форм гастроэнтеритов и геморрагических колитов, которые наблюдаются в 10-20% всех инфекций. При формировании гемолитического уремического синдрома (HUS) или тромбозной тромбоцитопенической пурпуры (ТТР) это может привести к опасным для жизни постинфекционным осложнениям в 5-10% инфекций, в особенности у детей и младенцев, но также и у стариков и пациентов с ослабленной иммунной системой. Летальные исходы в случае HUS и TTP в особенности высоки (прибл. 10-15%) у детей. Инфекция может привести к острому поражению почек, что потребует временного проведения гемодиализа, но возможна и необратимая потеря функции почек, после чего гемодиализ будет необходим постоянно. Различия в клинической картине, с одной стороны, зависят от предрасположенности пациента, а, с другой стороны, от соответствующих ЕНЕС-фенотипов. Это означает, что развитие болезни также зависит от различной степени экспрессии патогенных факторов. До сих пор важную роль играют и неизвестные в настоящее время факторы. Инкубационный период зависит от масштаба инфекции и может колебаться от 1 до 3 дней, иногда продолжаясь до 8 дней. Из-за высокой устойчивости в окружающей среде и относительной устойчивости к кислотам инфекционный уровень ЕНЕС составляет приблизительно 100 бактерий. Основным источником инфекции являются продукты, приготовленные из мяса крупного рогатого скота, овец и коз, в особенности непрожаренные и непроваренные мясо и мясные продукты и непастеризованное молоко. Также важное значение имеют цепочки передачи инфекции от человека к человеку, в особенности в таких общественных учреждениях, как детские учреждения, дома престарелых или госпитали, а также непосредственный контакт с животными. В окружении пациентов определяют бессимптомных носителей инфекции. Оказалось, что некоторые из общепринятых диагностических методов определения инфекции ЕНЕС имеют определенные недостатки. Так как только около 1% бактерий E. coli, которые точно принадлежат к группе ЕНЕС, способны продуцировать энтерогемолизин, обнаружение энтерогемолитических бактерий E. coli на кровяном агаре – действительно важный индикатор присутствия ЕНЕС. Но существуют также бактерии ЕНЕС, которые были изолированы у пациентов, больных HUS и которые не продуцируют энтерогемолизин. Кроме того, было показано, что первый обнаруженный тип О157 ответственен только за 70-80% всех случаев HUS, обнаруживаемых в Германии. В случае чистых гастроэнтеритов доминируют другие серотипы. Таким образом, определение только серотипа О157 недостаточно. В настоящее время рекомендована диагностическая процедура, состоящая в обогащении патогена в течение ночи в среде mTSB (с добавлением митомицина С, 50 нг/мл) с последующим выделением. Чтобы надежно доказать присутствие патогенного фактора, необходимо одновременно провести определение веротоксина в культуре клеток. Это можно сделать с применением иммунологических методов ИФА или, определяя цитопатическое влияние на культуру вероклеток (цитотоксическое определение). По сравнению с цитотоксическим определением такой иммуноферментный тест, как RIDASCREEN® Verotoxin EIA – простой метод, который можно применять в каждой лаборатории. Для того и другого методов необходимо обогащение бактерий, так как их экскреция, а также содержание токсина в кале могут быть очень низкими. В особенности для пациентов с HUS и TTP экскреция может прекратиться полностью. Чтобы получить быстрые результаты, в некоторых случаях можно определить токсин непосредственно в образце кала без обогащения. Из-за низкой чувствительности этой процедуры отрицательные результаты могут интерпретироваться только как предварительные. В этом случае рекомендуется дождаться результатов определения после обогащения культуры бактерий. При терапии HUS и TTP можно рекомендовать только симптоматическое лечение. Оно обычно состоит в форсированном диурезе и плазмафорезе. В случае полной почечной недостаточности применяют гемо- или брюшинный диализ. Антибактериальную терапию обычно не применяют, так как экскреция бактерий увеличивается, а образование токсина даже стимулируется.
Принцип метода
В иммуноферментном тесте RIDASCREEN® Verotoxin используются специфические антитела и принципы сэндвич-анализа. На поверхность лунок микропланшета адсорбируют специфические антитела к веротоксину 1 и 2. В лунки вносят разведенные тестируемые образцы кала и контроли и инкубируют при комнатной температуре (20-25оС). После процедуры промывки в лунки вносят специфические антитела к веротоксинам, конъюгированные с пероксидазой хрена, и планшет инкубируют при комнатной температуре (20-25оС). Если в образце присутствует веротоксин, образуется сэндвич-комплекс, сформированный иммобилизованными антителами, веротоксинами и антителами, конъюгированными с ферментом. Несвязавшиеся меченные ферментом антитела удаляют промывкой. Если тест положительный, после внесения субстрата фермент, связавшийся с лунками, превращает бесцветный субстрат в окрашенный в синий цвет продукт. Добавление стоп-реагента меняет окраску с синего цвета на желтый. Оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации токсина, присутствующего в образце.
Регистрационное удостоверение
Справка ВНИИС
Наборы реагентов для иммунологических исследований (справка ВНИИС) (PDF, 354 Кб)
Инструкция
С 2201 Веротоксин (RIDASCREEN Verotoxin) (PDF, 282 Кб)
(Производитель может вносить изменения в инструкцию по применению. За версией инструкции для конкретного лота диагностического набора/реагента обращайтесь в отдел продукции ЗАО "Аналитика")